背景
EGFR突变在NSCLC的靶向治疗中扮演着重要角色。服用EGFR-TKIs获得性耐药患者中出现TM突变的约50%。由于肿瘤组织检测的异质性，低的突变丰度，部分晚期肺癌的再活检困难，因此ctDNA检测被推荐作为非侵害性的检测方法，且ctDNAEGFR突变检测可指导EGFRTKIs一线治疗。分子检测被认为是NSCLC治疗的标准流程，标准商业化试剂盒及EGFR突变检测平台也随之应运而生。
1、检测平台介绍
目前可用于EGFR突变检测平台包括cobas、ARMS、BEAMing、dPCR、HRM、DHPLC、质谱基因分型、EFIRM、NGS。下面我们介绍几种较为常用的检测平台。（表1列出了相应检测平台的特征）
Cobas是一种基于RT-PCR技术平台，可检测42种EGFR突变（包括M），操作流程较为简单，第一步：DNA抽提，第二部：扩增及检测。组织和血液分别有不同的DNA/cfDNA抽提试剂盒，Cobas同一个上样板上可同时进行同一患者组织和血液样本头对头的检测对比，为临床提供更为客观的诊断结果。（图2为Cobas组织/血液检测操作流程介绍）
ARMS等位基因特异性聚合酶链式反应采用特殊PCR引物，用来检测小片段的缺失或单碱基突变。特定突变序列在Taq酶的作用下进行选择性扩增，仅对目的序列进行扩增，扩增过程同时释放荧光信号。PCR引物与一个探针共价结合，探针上有荧光基团和猝灭基团（猝灭基团用来抑制荧光基团），当扩增反应发生时，荧光基团才会释放。（图1）通过收集荧光信号来判读结果。
图1:三种ARMS-PCR技术荧光激发方式
cobas?EGFRmutationtestKit产品资料;Qiagentherascreen?EGFRRGQPCRKit产品资料;艾德ADXEGFR基因突变检测试剂盒产品资料
ARMS(Qiagen):EGFRRGQPCRV2试剂盒对应Rotor-GeneQ5plexHRM荧光定量PCR仪。
ARMS(AmoyDx):AmoyDx?EGFR突变检测试剂盒可覆盖18-21外显子上常见EGFR突变。其技术采用了新型探针设计，可检测新鲜/冰冻组织、血清、血浆。
图2：Cobas、ARMS检测流程
表1：EGFR突变检测平台对比
DigitalPCR是通过克隆扩增来确定核酸数。不同的等位基因可以通过不同的荧光基团或序列来区分。其不同于传统PCR根据线性数字信号经统计分析输出结果。
BEAMingDigitalPCR技术是一个高灵敏度检测平台，结合了含磁珠的油包水的乳化微滴、流式细胞仪。第一步DNA提取后PCR扩增作为DNA的富集；第二步，制造出几百万个水和油的乳化微滴，每一个乳化微滴中有一个磁珠，磁珠上包被了基因特异的引物，用来扩增目标序列。这样每个磁珠上就包上了几千个与原始模板一样的DNA拷贝，把小液滴破坏后磁珠释放出来，其上附带了突变DNA及正常的DNA拷贝，通过磁吸，把磁珠回收，用碱基特异性荧光探针与磁珠上的DNA片段进行杂交，用流失细胞仪区分突变和正常的DNA。（图3）
图3:dPCR（BEAMing）的操作流程：BEAMing操作流程：微滴生成、乳化PCR扩增、杂交、流式细胞仪计数。
ddPCR(Bio-rad)技术是基于油包水的微滴技术。包含目的基因的DNA样本被分到个微滴中，扩增包含目标基因的DNA后，经PCR-DNA终点法测定，含目标基因的被记作阳性微滴。（图4）这种方法无需标准曲线，且绝对定量，对比RT-PCR有较高的灵敏性。
图4:液滴式数字PCR：试剂准备、微滴生成（将样本分成个微滴）、乳化PCR扩增（在热循环器上进行PCR）、微滴计数（将阳性微滴和阴性微滴计数）、结果（液滴读取仪计算目的标本DNA拷贝数）
3dPCR使用了封闭的芯片技术。相比于其他数字平台其价格更为优惠（约50%）。其PCR反应在一个20K的芯片上完成，样本被自动芯片加载系统密封于芯片上。芯片在热循环仪上扩增后，直接在3dPCR仪上读取并分析结果。
NGS彻底改变了基因组分析中的生物学研究。IlluminaMiSeq常被用于靶基因测序，MiSeqDx系统常被用于分子诊断。Miseq合成测序平台基于可逆终端测序方式检测DNA链上的单个基因，这种碱基测序法消除了误差，质量较高。赛默飞世尔IonTorrentNGS技术是一种半导体芯片技术，简单，易推广且成本低，用于靶基因测序。IonAmpliSeq技术1ngDNA/RNA就可以扩增成千的目标基因，他可以用于FFPE样本及ctDNA的检测，测序时间至少要2天。IonTorrentOn北京白癜风治疗价格白癜风的外用药