恶性胸腔积液（MPE）常由恶性肿瘤引起，特别是肺癌。如何早期诊断对患者预后有重大的意义。寻找一种取样简单、创伤性小、特异性及敏感性良好的早期诊断标志物非常重要。今天我们来看看这篇研究如何从唾液中找到与预后相关的分子标志物。
概览为了寻找一种取样简单、创伤性小、特异性及敏感性良好的早期诊断标志物，作者对恶性胸水患者与正常人的唾液miRNA进行了表达差异检测，最终确定hsa-miR-和hsa-miR--3p为诊断MPE患者的潜在生物标志物。同时作者还发现在肺鳞癌患者中，这两种miRNA的过度表达常预示更好的总体生存率。
研究背景恶性胸水诊断方法的现状：1.恶性胸腔积液预示着全身性癌症扩散及患者预期寿命和质量下降。
2.临床医生一般首选胸腔积液细胞学分析，细胞学分析的诊断效率较低，灵敏度范围在40%和70%之间。
3.闭合性胸膜活检是另一种方法，但当胸腔积液深度低于10毫米时则无法进行。
4.检测胸腔积液中的肿瘤标记物，但是这种方法的灵敏度只有25-88%。
5.内科胸腔镜是诊断胸腔积液的一种高度敏感(92.7%)的方法，但是需要较高技术支持，并且成本高。
故而迫切需要一种有效的、微创的方法来尽早、准确地诊断MPE。
唾液作为生物标志物的现状唾液是一种容易取得的体液，含有多种成分，如蛋白质、DNA、RNA和代谢物，可能是潜在的有效生物标志物。现有许多研究证实了唾液生物标记物的诊断价值。
故而本文作者开始了是否能够从唾液找到诊断恶性胸水的生物学标志物的研究。结果如何？接着往下看吧！
研究方法研究设计这是一项回顾性病例对照研究，分成发现阶段和验证阶段两个阶段。Figure1展示了研究的流程。恶性胸腔积液患者（MPE）、良性胸腔积液(BPE)患者、有恶性肿瘤但无胸腔积液的患者(MT)和健康对照者(HCs)
发现阶段：随机招募了三名MPE患者和三名HC患者的六份唾液样本。使用miRNA阵列来检测唾液样本中miRNA谱。
验证阶段：包括54名恶性胸腔积液患者、33名良性胸腔积液患者(BPE)、50名MT患者和46名HCs，使用qPCR检测miRNA。
患者的纳入年1月1日至年7月1日之间，医院收治例有或无胸腔积液患者。对所有患者进行了初步诊断检查，最终纳入了57名确诊为MPE的患者、33名确诊为BPE的患者、50名确诊为MT的患者和49名健康对照者。纳入和排除标准如FigureS1。
唾液样本的获取1.在收集唾液之前，要求所有患者和医护人员避免饮酒、进食或吸烟至少2小时。
2.每个受试者至少收集3毫升唾液。
3.所有样品在4℃下以×g离心15分钟以去除细胞。仅将上清液转移到2mL离心管中。然后，为了完全除去细胞成分，在4℃下离心10分钟，离心×g。将上清液转移到2mL离心管中，并在80℃下储存直至使用。
微阵列分析在发现阶段，使用Affymetrix基因芯片miRNA4.0阵列检测唾液样本的miRNA谱。总共有个微小核糖核酸被组装到微小核糖核酸微阵列中，其中两个选为候选生物标志物。
选择标准：1.比较MPE组和对照组的平均miRNA表达水平。当P值0.05时，差异有统计学意义。2.选择显示至少2倍标的差异的微小核糖核酸进入验证阶段。
统计分析1.所有分析均使用SPSS软件。
2.采用学生t检验分析两组间差异的显著性。
3.变量之间的相关系数采用皮尔逊相关检验。
4.受试者工作特征曲线和曲线下面积用于评估微小核糖核酸的诊断价值。还分析了敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比和阴性似然比。该研究还评估了这些参数的95%置信区间。
5.P值0.05时，差异有统计学意义。
结果恶性胸水患者与健康对照者的特点表1显示了两个试验阶段恶性胸水组与健康对照组受试者的基线特征。
发现阶段
1.MPE组有2女1男，HC组有3女。
2.平均年龄分别为78±3岁和63±8.89岁。
3.三名MPE患者中有一名是吸烟者，HC组都不是是吸烟者。三例MPE患者的组织学类型均为腺癌。
验证阶段
1.男性在MPE组、BPE组、MT和组中的HC组百分比分别为51.9%、66.7%、60.0%和41.3%；
2.四组患者的平均年龄分别为61.87±13.13岁、59.82±13.61岁、62.02±13.24岁和55.80±14.38岁；
3.这四组中吸烟者的比例分别为50%、39.4%、46.0%和58.7%。
4.54例MPE患者中，有26例腺癌、12例小细胞肺癌、9例鳞状细胞癌和7例恶性间皮瘤。33例BPE组患者中，12名为肺旁积液患者，9名为结核性胸腔积液患者，5名为渗出性胸腔积液患者。6例胸腔积液为结缔组织病所致，1例为肺栓塞所致。在50例MT患者中，腺癌20例，小细胞肺癌19例，鳞状细胞癌11例。
这些组的的年龄、性别和吸烟史没有统计学差异。
MPE患者及HC患者的唾液miRNA谱图2是MPE组和HC组的唾液miRNA微矩阵结果热图。在发现阶段，通过对MPE组及HC组的六名患者进行唾液miRNA微矩阵分析，发现共有29个miRNA上调，48个miRNA下调。选择hsa-miR-(P=0.，变化倍数=5.)和hsa-miR--3p(P=0.，变化倍数=2.)用于随后的验证阶段。Hsa-miR-在MPE患者中显示显著的上调，而hsa-miR--3p显示下调。
唾液生物标记的验证和生物标记组合分析图3展示了四组患者的唾液中两种miRNA的PCR结果。可以发现，在MPE患者中，hsa-miR-显著上调，hsa-miR--3p显著下调。这些结果与微阵列分析结果一致。
图4展示了两种唾液miRNA作为检测分子标志物的ROC曲线；表2是两种唾液miRNA作为检测分子标志物的ROC检测结果。
从图中可发现，hsa-miR-和hsa-miR--3p的AUC分别为0.和0.。灵敏度分别为74.1%和50.4%，特异性分别为74.4%和79.6%。两个组合，灵敏度为82.2%，特异性为74.1%，AUC为0.。结合图4和表2，可知hsa-miR-和hsa-miR--3p的组合在诊断MPE方面具有高诊断性能。探究影响两种唾液miRNA表达的相关因素图5展示了两种唾液miRNA的含量与MPE、胸腔积液量之间相关性分析结果。唾液中的hsa-miR-水平与MPE相关（P=0.），而hsa-miR--3p与MPE无相关性(P-0.)。唾液中的微小核糖核酸水平高于MPE(P=0.)。唾液miRNA水平和胸腔积液量之间没有相关性。
讨论唾液miRNA与传统肿瘤标志物对比
1.CEA，CA15-3，CA19-9,CA和CYFRA21-1，是5种最常用的肺癌标志物。最有效的标志物是CEA，灵敏度为0.，特异性为0.。并没有唾液hsa-miR-有效。
2.传统诊断方法对胸腔积液容积要求较高。研究发现，miRNA水平与胸腔积液量无关。因此，唾液miRNA可以在较少积液时就可以检出异常。
两种miRNAs与总生存率之间的相关性
为了探究hsa-miR-和hsa-miR--3p的功能，作者分析这两种miRNAs与总生存率之间的相关性。从图S2中可知，在肺鳞癌患者中，这两种miRNA的过度表达常预示更好的总体生存率。这一结果表明在肺鳞癌中hsa-miR-和hsa-miR-具有保护作用。
局限性
1.未解释MPE如何导致唾液miRNAs谱的变化。
2.纳入的MPE患者都是由肺癌引起的,其他恶性疾病诱发的MPE是否也存在唾液miRNA谱的变化？
3.纳入的人群样本量相对较小，都是来自同一个国家，同一种族，需要更大样本量的多中心前瞻性研究。
参考文献：YangY,MaL,QiaoX,ZhangX,DongSF,WuMT,ZhaiK,ShiHZ.SalivarymicroRNAsshowpotentialasbiomarkersforearlydiagnosisofmalignantpleuraleffusion.TranslLungCancerRes.Aug;9(4):-7.doi:10./tlcr-19-.PMID:;PMCID:PMC.
编辑：姚佳镕
校审：吕琼
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