《全球临床溶瘤病毒项目介绍--技术篇》
上期我们对溶瘤病毒的行业概况及竞争格局进行了介绍，本期开始我们将对溶瘤病毒的临床在研项目进行更为详细的介绍，包括其技术路线、临床试验方案及试验结果等。
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溶瘤病毒的设计与改造
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1、常见的溶瘤病毒类型
临床上常用的溶瘤病毒种类包括DNA病毒和RNA病毒。DNA病毒以腺病毒、牛痘病毒、疱疹病毒和细小病毒H1为代表，主要特点对比如下表所示。
表1常见DNA病毒[1]
如上表所示，腺病毒、牛痘病毒和疱疹病毒的特性较为类似，而单链DNA病毒的各项特征均与双链DNA有所区别，例如，细小病毒H1不会整合进宿主的DNA中，不会引起插入致突变性，优先在肿瘤细胞中复制，可穿越血脑屏障，对抗病毒药物没有响应。另外，部分腺病毒和细小病毒H1具有血凝作用，因此可以通过血凝抑制试验对患者血清中的抗体进行评价。
另外，DNA病毒基因组容量较大，除细小病毒H1外，腺病毒、牛痘病毒、疱疹病毒均为双链DNA病毒。双链DNA病毒通常在宿主细胞核内合成DNA，在细胞质内翻译出病毒。单链DNA的复制方式为半保留复制，病毒侵入细胞后，在宿主细胞核内，依赖宿主细胞的酶，以单链DNA为模板，形成双链DNA[2]。DNA病毒相对更稳定，变异速率较低。
RNA病毒以呼肠孤病毒、柯萨奇病毒、塞内卡谷病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、新城疫病毒及水泡性口炎病毒为主。
表2常见RNA病毒[1]
由上表可知，不同类型的RNA病毒各项特征之间前均有所不同，但均不会整合进宿主的基因组中，且对抗病毒药物没有响应。另外，RNA病毒的基因组较小，通常仅编码几种蛋白质。RNA病毒主要是单链RNA病毒，通过上表可以看出，除呼肠孤病毒外，均为单链RNA病毒，单链RNA病毒又可分为正链RNA以及负链RNA。大多数有包膜的RNA病毒属于负链RNA，这类病毒本身多含有依赖于RNA的RNA聚合酶，基因组核酸单独没有感染性。病毒连同核酸和酶一起侵入宿主细胞后，借助病毒带入的RNA聚合酶合成正链RNA、负链RNA、RNA聚合酶和相关蛋白，蛋白质再与负链RNA组装成新的病毒颗粒。正链RNA病毒基因组RNA直接具有mRNA功能，病毒核酸即具有感染性。
正链RNA既可以作为mRNA指导病毒蛋白质的合成，又可以作为模板复制负链RNA。大多数双链RNA病毒都在宿主细胞质内合成病毒全部成分[2]。RNA病毒的复制过程中，其错误修复机制的酶的活性很低，几乎是没有的，所以其变异很快。
2、溶瘤病毒的改造
溶瘤病毒通过在肿瘤细胞内复制并使肿瘤细胞裂解，同时激发机体抗肿瘤免疫应答达到抗肿瘤作用，为达到更好的抗肿瘤效果，增强溶瘤病毒对肿瘤细胞的靶向性、增强其引起的机体免疫应答是溶瘤病毒改造的主要目的。
增强对肿瘤细胞的靶向性的方法[3]包括:
1）使病毒在正常细胞中复制必需的基因缺失，导致缺陷病毒在正常细胞中不能有效复制，但不影响在肿瘤细胞中的复制。2）选择性靶向抑癌基因失活或相关信号通路缺陷的肿瘤细胞，使病毒仅在缺陷肿瘤细胞内复制，在正常细胞内只是少量存在或不能增殖。3）将肿瘤或组织特异的启动子插入到病毒复制的关键基因上游，使病毒只在肿瘤或特异组织中复制。4）针对肿瘤细胞或是肿瘤组织内血管表达的特异性受体或配体，在病毒表面装载上相应的特异识别蛋白序列，获得靶向效果等。
除上述方法外，为保护溶瘤病毒不被抗体中和，促进其递送至肿瘤组织，也有采用细胞载体（例如间充质干细胞、神经干细胞、T细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞等）运送溶瘤病毒的设计方向。
为了增强机体的免疫应答能力[3]，可以携带某些增强机体免疫能力的基因及其表达产物，如携带表达IL-4、IL-12和GM-CSF基因等。此外，为阻止肿瘤细胞的免疫逃逸，可携带免疫抑制基因及表达产物，如携带表达抗PD-1/L1和抗CTLA-4基因，最终达到调节免疫能力和清除肿瘤细胞的目的。
除增强溶瘤病毒疗效外，还可通过基因工程提高溶瘤病毒安全性，降低其对于正常细胞的毒性，如敲除HSV-1的34.5基因，该基因删除后，病毒在神经细胞中的复制能力降低失去神经毒性，但是仍能在快速分裂的细胞中复制。
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全球在研品种分析
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基于不同种类病毒的不同特性，全球66个临床在研品种所用病毒株类型如下图所示。
图1全球在研溶瘤病毒类型分布
（数据来源：开心生活团队依据公开信息整理）
腺病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒是目前临床研究中使用最广的病毒类型，3者合计占77%。下面对不同病毒类型进行概述。
1、腺病毒
1.1
腺病毒属线性双链DNA病毒，病毒颗粒直径65-90nm，为无包膜二十面体结构，人基因组长约36kb，包括早期转录基因（E1A、E1B、E2、E3、E4）和晚期转录基因（L1–L5）[4]。其两端各有一个反向末端重复区（ITR），ITR内侧为病毒包装信号。
图2腺病毒基因组[5]
腺病毒感染细胞主要分为3个步骤：
1)腺病毒的纤维蛋白与宿主细胞膜上的腺病毒-柯萨奇受体（Coxsackievirus-adenovirusreceptor，CAR）结合；
2)病毒与整合素受体结合，经过内吞作用进入细胞，脱去衣壳，病毒DNA通过核孔进入宿主细胞核；
3)基因转录及病毒DNA复制[6]。
1.2
在研项目
在30个在研腺病毒项目中，2个处于临床III期，13个处于临床II期，15个处于临床I期。2个临床III期品种为前述Advantagene开发的AglatimageneBesadenovec以及CGOncology开发的CG-。
AglatimageneBesadenovec
Aglatimagenebesadenovec（AdV-Tk）是Advantagene开发的一种腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因疗法，目前开展多个临床试验，其中治疗前列腺癌、肝细胞癌的临床试验处于临床III期，治疗胶质瘤、非小细胞肺癌和胰腺癌的临床试验处于临床II期和治疗恶性胸腔积液处于临床I期。
年，Advantagene宣布获得NorthpondVentures领投的万美元C轮融资，所得款项将用于加速正在进行的临床计划并启动针对脑癌患者的GMCI?疗法关键试验。
作用机制
AdV-Tk可在感染的癌细胞内表达单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）基因。在直接杀死癌细胞的同时释放引起免疫系统过度刺激的蛋白，从而激活免疫途径。
GMCI?是专有的基因介导的细胞毒性免疫疗法（Gene-mediatedcytotoxicimmunotherapy），该方法为AdV-tk结合放射疗法以及抗疱疹的前体药物Valacyclovir，共同治疗恶性肿瘤。
AdV-Tk与Valacyclovir联用时，AdV-tk表达的胸苷激酶可使Valacyclovir磷酸化为核苷酸类似物，抑制DNA复制或修复，并诱导细胞死亡，从而引发免疫激活危险信号，刺激抗原呈递细胞成熟和CD8+T细胞扩增。
临床试验
GMCI?疗法已在前列腺癌、脑癌、胰腺癌和肺癌等多种适应症开展11项已完成的临床试验和5项进行中的临床试验，已在名患者中使用了余次，显示出良好的耐受性和安全性。
胶质母细胞瘤方面，一项临床II期试验（NCT）评估了GMCI?疗法作为辅助治疗，联合手术+放疗+替莫唑胺（TMZ）的标准疗法（StandardofCare，SoC）在新发恶性胶质瘤患者中的安全性及有效性，共计48位患者接受了GMCI?+SoC的治疗，例接受SoC的患者作为对照组。
图3GMCI介入方式[7]
初步数据结果显示[7]，48位接受GMCI?+SoC的患者mOS为17.1个月，而仅接受SoC的患者mOS为13.5个月（P=0.）。GMCI?+SoC组患者的1、2和3年生存率分别为66.7%、35.4%和18.8%，而SoC组患者的生存率为56.7%、21.6%和7.5%。
图4GMCI在新发恶性胶质瘤中的有效性结果[7]
在肿瘤全切除患者中观察到最大获益：所有接受GMCI?+SoC治疗的肿瘤全切除患者mOS为25个月，而SoC组肿瘤全切除患者mOS为16.9个月（P=0.）；GMCI?+SoC组1年、2年和3年生存率分别为89.5%、52.6%和31.6%，而SoC组为63.8%、27.7%和6.4%。在肿瘤部分切除患者中，GMCI?+OC组和SoC组的mOS无显著性差异。在GBM亚组中可观察到相同的结论，GMCI?+SoC组mOS为25.1个月，SoC组mOS为16.3个月（P=0.）。
图5不同肿瘤切除程度下GMCI的有效性[7]
安全性方面，大多数不良反应由潜在疾病、手术、放疗或TMZ导致。GMCI?耐受性良好，未出现剂量限制的毒性；常见的GMCI?治疗相关不良反应为疲劳、发烧及头痛。1例受试者在术后立即发展为4级偏瘫，同时基线言语障碍恶化至3级，随后两者均得到改善。唯一可能相关的3级不良反应是失眠、头痛和伤口并发症。
非小细胞肺癌方面，Advantagene在ASCO上公开了AdV-Tk治疗非小细胞肺癌的临床I期数据[8]。通过支气管内超声（n=11）或纵隔镜（n=1）进行单次AdV-tk注射。从注射AdV-tk后的第二天开始Valacyclovir治疗14天。结果显示AdV-Tk可有效诱导CD8+T细胞活化。治疗后发现肿瘤中CD8+T细胞浸润是基线的5.2倍（p=0.）。
安全性方面，无剂量依赖性毒性，不良反应包括流感样症状（1例），恶心/呕吐/腹泻（与伐昔洛韦有关）（1例），仅有2级实验室异常是短暂的3级淋巴细胞减少（2例）。没有证据表明AdV-tk递送后引起缺氧或肺实质炎性反应。
其他腺病毒项目请